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發(fā)布日期:12/14/2022 4:21:00 PM

超濾管采用垂直結構的膜減少濃差極化,加快了離心速度,大大了離心所需的時間,整個離心操作大概10-30分鐘。倒轉離心回濃縮后的樣品保證極高的回收率(>90%的高回收率),濃縮倍數(shù)可達25~30倍。內(nèi)置低吸附的Ultracel-PL超濾膜,分別有3KD、10KD、30KD、50KD、100KD五種截留規(guī)格,是蛋白質溶液、細胞裂解液、組織培養(yǎng)液等生物樣品濃縮、脫鹽和緩沖液更換的理想選擇。廣泛應用于蛋白、抗原、抗體、酶、病毒和微生物等稀溶液或純化后的蛋白質(如層析洗脫液)的濃縮、脫鹽與純化。

       蛋白濃縮和換Buffer通常使用的超濾管,常用Millipore的Amicon-Ultra-15超濾管(MWCO10kD)。也有其它型號的、不同體積大小和MWCO超濾管可選,視目的蛋白的分子量與濃縮前體積、濃縮目標體積而定。

 

技術指標:

       ①大起始樣品處理量:15ml(吊籃轉子)、12ML(35°固定角度轉子),典型濃縮后終體積為200ul;

       ②內(nèi)置超濾膜為Ultracel-PL纖維素超濾膜;

       ③適合50ML離心機轉子;

       ④大離心力:吊籃式轉子為4000×g;35°固定角度轉子5000×g;

       ⑤尺寸:有效膜面積為7.6cm2,直徑為35mm,長度為121mm;

       ⑥管壁上標有截留規(guī)格。

 

使用方法:

       1、選擇合適的超濾管,主要考慮MWCO和濃縮體積,常見的是Ultra-15(10kD)。到底選擇多大截留分子量比較合適呢?10kDa、 5kDa、還是30kDa?通常應截留分子量不應大于目的蛋白分子量的1/3,比如目的蛋白分子量為35kDa,就可以選擇10kDa截留分子量的超濾 管。若目的蛋白分子量為10kD左右,則可以用截留分子量3kD的超濾管。認真閱讀使用說明書,注意超濾膜對各種化學物質的耐受程度有所不同,表格中有。

       2、新買來的超濾是干燥的,使用前加入MilliQ水,水量完全過膜,冰浴或冰箱里預冷幾分鐘。然后將水倒出,即可加入蛋白液,加入的多少,以不超過管頂?shù)陌拙€為準。操作要輕,加入蛋白液前,超濾管需要插在冰上預冷。

       3、平衡。質量和重心二者都要達到平衡。注意轉速和加速度不可太快,否則直接損壞超濾膜。開始離心超濾(離心機預冷至4度)。不同離心機的轉速 rpm換算成g之后,有所不同。具體可參閱附件里的說明書。離心機的加速度調至低檔,減小對膜的壓力。注意,一定要等離心機達到目的轉速之后,方可離開離心機,否則離心機出問題時,無法時間處理,后果不可預測!膜與轉軸的方向根據(jù)說明書調整(角轉離心機的情況是膜與軸垂直)。在實際使用中,一般轉速開的比說明書里的要低,這樣可以延長離心管的使用壽命。

       4、當濃縮到剩下1ml時,【取50ul國產(chǎn)Bradford溶液,加入10ul流穿,看有沒變藍色,以此判斷超濾管是否漏掉蛋白。如果管漏了,將上層和流穿重新倒入新管中開始超濾。要判斷是否漏管,用5mg/ml的BSA離心10min,再取流穿,跑蛋白膠或Bradford粗測】,繼續(xù)加入剩下的蛋白液濃縮(在冰上操作,防止蛋白受熱),直到所有濃縮液都加完為止。離心過程中注意是否發(fā)生蛋白沉淀,導致堵管。若發(fā)生沉淀,要確定沉淀的具體原因,是蛋白濃度過高還是Buffer不合適;前者可用多根超濾管同時超濾,降低濃度的辦法解決,后者的方法是換不同的Buffer,直到蛋白不發(fā)生沉淀為止。

       5、前面幾步用以濃縮蛋白,如果要換Buffer,在總蛋白液濃縮至1ml左右的時候,輕輕加入新的Buffer(經(jīng)0.22um超濾膜超濾),再 濃縮至1ml左右,連續(xù)三次,后一次的濃縮終體積根據(jù)需要的蛋白濃度而定,一般不多于500ul,也有濃縮至200ul以內(nèi)的情況。按照每次至少10倍 左右的體積濃縮算,三次達到1000倍以上,基本上可以達到換buffer的目的。

       6、取出終蛋白濃縮液的操作在冰上操作,用黃槍頭(200ul)取,輕輕順著邊緣插入槍頭,輕輕吹打、混勻蛋白液,注意不要碰到超濾膜,然后吸取濃縮液,每次吸接近200ul,直到吸完。管底剩下的后一點濃縮液不必吸取,否則難度太大,有可能損壞超濾膜。后加入MilliQ水到超濾管中,沒過 超濾膜,防止膜失水變干。

 

注意事項:

       若實驗需要截留住目標蛋白,Millipore公司建議選擇比目標蛋白大小至少小2-3倍纖維素超濾膜材質的超濾管。如果是聚醚砜超濾膜材質超濾管,則所選擇超濾管規(guī)格大小比目標蛋白至少小4-5倍。

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